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    定量磷酸化蛋白质组学

           
           
    蛋白质磷酸化是生物体中较常见的一种蛋白质翻译后修饰方式,它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程,所以磷酸化一直是生物学研究的重点与热点。定量磷酸化蛋白质组学的经典研究技术路线如图1。首先,蛋白提取之后酶解成肽段,对肽段进行富集,然后将磷酸化肽段进行LC-MS/MS定量分析。 在LC-MS/MS定量分析阶段,又分为Label free和iTRAQ/TMT标记两种方法。

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                                                             图1   定量磷酸化蛋白质组学技术路线

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    磷酸化非标记定量蛋白组学(Label free 法)

             根据一级质谱相关的磷酸化肽段峰强度、峰面积、液相色谱保留时间等信息,基于磷酸化肽段母离子强度(或色谱离子流的峰面积),以一级质谱MS1为定量基础,计算每个磷酸化肽段的信号强度在LC-MS色谱上的积分,进行磷酸化定量。

    技术优势

            1、无需昂贵的同位素标记试剂,实验耗费低

            2、不受样本数量限制,克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷

            3、对样本的操作少,从而使其最接近原始状态

    技术路线

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                                                                         图2   Label free技术路线

     

    磷酸化标记定量蛋白组学(iTRAQ/TMT法)

    工作原理     

            根据报告离子的峰面积计算同一蛋白质同一磷酸化肽段在不同样品间的比值,从而实现磷酸化蛋白的相对和绝对定量。不同标记试剂与来源于不同样品胰酶消化后的肽段结合,经过色谱分离,并通过一级质谱和二级质谱。平衡基团在二级质谱发生中性丢失,报告基团在二级质谱低质量区域产生多个报告离子,其信号强度分别代表该标记样品的表达量。

    技术优势

            1、iTRAQ可同时对8个样本进行分析,TMT可同时对10个样本进行分析

            2、定量更准确,重复性高

            3、蛋白检测范围广

    技术路线

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    3  iTRAQ/TMT技术路线

    应用领域

    •      疾病标志物筛选

    •      作用机制研究

    •      植物胁迫/抗逆研究

    •      药物作用靶点研究

    •      特殊功能蛋白质筛选

    样品要求

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    仪器设备

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                          QE HF                                                                            Orbitrap Fusion Lumos

    经典案例解析

    磷酸化蛋白质组揭示昼夜节律调控机制

    文献:Phosphorylation is a Central Mechanism for Circadian Control of Metabolism and Physiology(IF=22.415

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    一、研究背景

            生物钟,作为生物体内一种无形的时钟,控制着生物体内几乎全部的代谢过程,并且其自身会不断优化以保证生物体的稳态和代谢健康。研究生物钟,在医学上有着重要的意义,并对生物学的基础理论研究起着促进作用。

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            Robles等学者对小鼠肝脏的昼夜节律性磷酸化蛋白组进行了分析,发现25%的定量磷酸化肽与蛋白组表达水平相比振荡幅度非常大。数据表明,磷酸化依赖的信号通路昼夜节律调节起主导作用。这使得生物体能够整合不同的信号,并对营养有效性和生理状态的变化做出快速反应。

    二、研究路线

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    三、研究结果

    1、小鼠肝脏的昼夜磷酸化蛋白质组学

            为了研究磷酸化修饰对代谢稳态和生物节律的关键性调节作用,研究人员首先利用label-free的方法研究了两天内不同时期小鼠肝脏组织蛋白磷酸化水平的变化(图4A)。结果发现,25%的磷酸化肽段,40%的磷酸化蛋白,其磷酸化水平出现显著的节奏性波动。小鼠肝脏组织中共鉴定到20,404个磷酸化肽段,20,076个磷酸化位点, 4,461个磷酸化蛋白,且定量重复性较高(图4B)。

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                                                         图4  小鼠肝脏磷酸化蛋白昼夜节律

     

    2、小鼠肝脏内磷酸表达水平每天较大的振幅振荡

            聚类分析将磷酸化水平周期性变化的蛋白分为两类,白天高表达类和夜间高表达类(图5A),小鼠分别处于非活跃和活跃状态,PCA分析同样在两个维度上将磷酸化蛋白质分为白天高表达和夜间高表达两类,同时发现磷酸化水平昼夜规律波动的肝脏蛋白显著富集在特定的代谢通路上,如胰岛素相关代谢途径、细胞自噬和昼夜节律相关的代谢途径(图5B),表明翻译后修饰在昼夜节律调控中起着关键作用。

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                   A 规律波动的磷酸化聚类分析                                      B  磷酸化蛋白的KEGG通路富集散点图

                                                              图5 小鼠肝脏磷酸化蛋白质组振荡


    3、磷酸化水平变化调控蛋白节律功能

            研究发现磷酸化修饰组和蛋白组在一天之内的不同时期表达水平差异很大(图6A),磷酸化修饰组的表达差异更大,一天之内出现约5倍的表达差异,显著高于蛋白组变化的水平,同时80%的磷酸化累积强度来自于20 %的磷酸化水平规律变化的蛋白,表明磷酸化水平振动的蛋白为调节蛋白而非结构蛋白(图6B)。研究人员在CLOCK蛋白上发现了新的磷酸化位点S446和S440/441 (图6C),其磷酸化水平也出现周期性的变化,由于CLOCK蛋白表达量是恒定的,表明磷酸化水平的变化是调节该蛋白节律功能的主要因素。上述结果均表明节律调控的核心机制为蛋白磷酸化水平的周期性变化。


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                                                      图6  周期变化的磷酸化蛋白的时期分布和变化水平

    4、磷酸化信号通路调节昼夜节律

            研究在特定信号途径的蛋白质中是否主要存在循环磷酸化位点,发现昼夜节律的肝脏磷酸化蛋白质组富含来自代谢途径的蛋白质。通过进行激酶-底物筛选实验,发现来自一组激酶的底物全天聚集在特定的阶段,表明这些激酶的时间活化(图7A)。对数据进行整理生成由小鼠肝脏中磷酸化的每日周期调节的信号通路。该图谱揭示小鼠信号传导的两个分支,分别对应于一天中的活跃和不活跃部分(图7B)。结果表明,小鼠体内的磷酸化周期是通过激活一组导致信号通路暂时整合的激酶来实现的,并最终调节响应细胞能量状态的代谢过程。

     

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                                                                       图7 磷酸化信号通路调控

     

    小结


           本文在磷酸化蛋白组水平上探讨小鼠的昼夜节律机制,利用基于质谱的蛋白组学技术在蛋白组水平对生物节律进行了研究,证实了蛋白质的磷酸化修饰对生物节律关键信号途径调节中的作用,以保证生物更快速、更经济有效地对外界环境的变化做出反应。

    相关文献

    1. Chen XJ, et al. Homoharringtonine deregulates transcriptional expression by directly binding NF-κB repressing factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Feb 5;116(6):2220-2225.

    2. Huang H, et al. Kisspeptin/GPR54 signaling restricts antiviral innate immune response through regulating calcineurin phosphatase activity. Science Advances, 2018, 4(8): eaas9784. 

    3. Sun H M, et al. PALLD Regulates Phagocytosis by Enabling Timely Actin Polymerization and Depolymerization. J Immunol. 2017 Sep 1; 199(5): 1817-1826. 

    4. Wang C,et al. Proteome Analysis of Potential Synaptic Vesicle Cycle Biomarkers in the Cerebrospinal Fluid of Patients with Sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease.Mol Neurobiol. 2017 Sep;54(7):5177-5191.

    5. Zhang B, et al. Comparative transcriptomic and proteomic analyses provide insights into the key genes involved in high-altitude adaptation in the Tibetan pig.Sci Rep. 2017 Jun 16;7(1):3654.