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    外泌体定量蛋白质组学

     

    外泌体研究背景:

           

            胞外囊泡是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体,主要由微囊泡、凋亡小体、外泌体组成。而外泌体是其中一类小囊泡,直径为40~100nm,密度1.10~1.18 g/ml,可携带核酸、蛋白质质和脂质等,存在于血液、唾液、尿液等多种体液中。

             越来越多的研究证实,外泌体可以通过细胞间转移核酸、蛋白质、脂质等特定物质,发挥特殊的功能。如在抗原提呈细胞中呈递抗原程中、肿瘤细胞发生发展、神经细胞信号转导过程中都发挥着重要作用。对外泌体的分析和检测可以辅助疾病的早期诊断、疗效评价和预后分析。

     

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    外泌体主要内容物——蛋白质:


             外泌体常用的数据库ExoCarta (http://www.exocarta.org),记录了超过286个外泌体研究的数据,其中就包含有41860种蛋白质,是所有记录的外泌体内容物中排名No. 1的分子。由此可见,外泌体内中的蛋白质成分在外泌体相关的生物学研究中占据着重要地位。由于外泌体中蛋白质分子具有多样性,无论从标志物角度还是疾病记录角度进行研究,外泌体蛋白质无疑会成为未来的明星分子。

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    外泌体研究经典案例:

    案例1——血清GPC1蛋白阳性外泌体可作为胰腺癌诊断标志物



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                    参考文献:Nature, 2015, 523(7559): 177.


    早期胰腺癌难以诊断,术后生存率低,外泌体+蛋白是否能够打破胰腺癌诊疗的魔咒?

            首先,研究人员通过质谱技术筛选多种癌细胞来源的和非癌细胞培养上清中外泌体携带的蛋白质差异,发现GPC1在胰腺癌细胞分泌的外泌体中特异富集。然后,利用ELISA技术对比了胰腺癌患者手术前后与各种对照(胰腺癌前病变、良性胰腺疾病、乳腺癌)患者血清中的 GPC1+ 外泌体。

            结论:确认GPC1+ 外泌体可作为胰腺癌预后诊断的有效标志物,诊断效率远高于现有标志物CA19-9。

    案例2——血浆外泌体S100-A9蛋白激活NF-κB促进淋巴瘤复发




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                     参考文献: Blood, 2017, 130(6): 777-788.

     


    血浆中的外泌体蛋白既可以当作标志物,也可以进行机理研究?

           首先,研究人员将慢性淋巴瘤(CLL)患者分为2个亚组:疾病进展期和疾病慢性期。然后利用质谱技术分析了患者血浆外泌体蛋白组,发现S100-A9蛋白在进展期CLL患者中明显高表达,可以作为CLL进展期诊断的辅助标志物。

            进一步,研究人员通过生信分析发现进展期CLL患者外泌体中的高表达蛋白质主要与炎症和氧化应激有关,而NF-κB通路正是承接此效应的关键通路。通过从进展期CLL患者中分离富含S100-A9蛋白的外泌体加入CLL患者的PBMC细胞中,证实了S100-A9+外泌体能够明显促进进展期CLL患者PBMC细胞中IκBα蛋白的磷酸化上调,进一步激活NF-κB通路。

           该研究证通过血浆外泌体蛋白组分析不仅找到辅助诊断进展期CLL的标志物,并证实了S100-A9+外泌体可通过形成正向反馈调控,不断激活进展期CLL患者自身PBMC细胞中的NF-κB通路,促进CLL进展的特殊机理。

    血清/血浆样本蛋白质组研究的难题

     

     

             几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体,同时外泌体也广泛存在于体液中,包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前文献报道较多的是基于血浆/血清进行外泌体研究。由于血小板在凝血过程中会分泌大量的外泌体到血清中,作为背景因素干扰外泌体的研究结果。因此,在非血小板相关的研究中,一般建议可以选择血浆样本进行实验。


     

     

     

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                       参考文献:Circ Res.2017.121(8): 920-922.

     


            然而,血浆/血清中含有大量的脂蛋白质,如高密度脂蛋白质HDL,低密度脂蛋白质LDL,高密度脂蛋白质HDL,乳糜微粒CM等。外泌体与这些脂蛋白质在物化性质上具有较大的相似性。常规的外泌体分离方法,如超速离心和沉淀法等都无法有效去除血浆/血清中的总蛋白,严重干扰了下游质谱实验数据的检出率和可靠性。成为限制血清/血浆外泌体蛋白质组研究的主要难题。

    外泌体蛋白组服务方案

     

            华盈生物开发了一套完整的外泌体蛋白质质组学研究技术服务体系,包含外泌体制备、外泌体鉴定、蛋白组定性定量分析、数据分析等各个环节。

            在外泌体制备阶段,根据客户需求,华盈生物既可以提供经典的超速离心分离服务,又可以提供脂蛋白去除效果更优的qEV尺寸排阻法分离服务。在外泌体鉴定阶段,华盈生物不仅可以提供经典的NTA分析,还可以提供准确度更高的TRPS分析。在外泌体蛋白组分析阶段,华盈生物可根据总体实验设计,提供基于标记和非标记的蛋白组学方法,并提供完备的验证服务。


     

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    样本要求


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    盈生物技术优势

    优势1:高纯度外泌体制备优势



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             与超离法相比,尺寸排阻法(qEV尺寸排阻分离柱)收集的富血清外泌体数量与总蛋白质量比值更高,说明尺寸排阻法富集的血清外泌体纯度更高,更有助于外泌体蛋白质组的检测与分析。

            外泌体研究顶级杂志J Extracell Vesicles中的文献报道:超离法只能部分去除LDL和VLDL,无法有效去除HDL,其收集的外泌体中存在大量污染蛋白质。而尺寸排阻法可有效去除LDL和VLDL,有效提高外泌体纯度。

       

     

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    优势2:微量样本需求

     

        华盈生物通过超离心法和尺寸排阻法(qEV分离柱)分别收集1.5 mL和500 μL血清中的外泌体,应用label free质谱技术进行外泌体蛋白质组学分析。结果显示超速离心共鉴定到533种蛋白质。而尺寸排阻法共鉴定到607种蛋白质,两种方法鉴定的蛋白质均包含CD9、CD63、CD81几种标志物,并且超过60%ExoCarta收录。

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    优势3:质谱+芯片双平台


            华盈生物拥有LC-MS/MS和抗体芯片两大技术平台, 针对不同的研究需求,选择更优的技术。Orbitrap Fusion Lumos是Thermo Fisher推出的顶级的质谱仪,具有超高分辨、高灵敏度、多级质谱能力,在外泌体蛋白组分析中发挥了巨大优势。抗体芯片,抗原抗体反应原因,不受高丰度蛋白干扰,数据准确度高,可有效检测微量指标如分泌型细胞因子的筛选。

     

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    抗体芯片:适用于特定种类分泌型蛋白质筛选研究,在大批量样品实验中具有优势。

     

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    质谱技术:适用于寻找广泛类型外泌体差异蛋白质谱,在膜蛋白质筛选上优势明显。

    优势4:丰富的项目经验


            华盈生物外泌体蛋白组服务平台拥有丰富的服务经验,不仅在各种细胞上清样本外泌体蛋白组研究中拥有稳定优势,在多个物种的血浆/血清样本外泌体研究中均有优秀的数据呈现,并不断突破检测上限。在组织、胆汁、胃液、微生物培养基等特殊样本的外泌体项目中也不断摸索形成了稳定的技术路线,承接越来越多的科研服务任务。

    已有项目经验:

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    代表外泌体蛋白组数据:

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    代表客户文章:


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    参考文献:


    免疫调控

    [1]Extracellular vesicles from Trypanosoma brucei mediate virulence factor transfer and cause host anemia. Cell. 2016; 164(1-2): 246-57.

    [2]Exosomes secreted by apoptosis-resistant AML blasts harbor regulatory network proteins potentially involved in antagonism of apoptosis. Mol Cell Proteomics. 2016 Jan 22. pii: mcp.M115.052944.

    肿瘤转移与血管生成

    [1]Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 2015; 527(7578): 329-35.

    [2]Proteomic analysis of exosomes from nasopharyngeal carcinoma cell identifies intercellular transfer of angiogenic proteins. Int J Cancer. 2015; 137(8): 1830-41.

    生物标志物

    [1]Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 2015; 523(7559): 177-82.

    [2]Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 2015; 17(6): 816-26.

    干细胞治疗

    [1]Comprehensive Proteomic Analysis of Mesenchymal Stem Cell Exosomes Reveals Modulation of Angiogenesis via NFkB Signaling. Stem Cells. 2016 Jan 19. doi: 10.1002/stem.2298.

    [2]Exosomes secreted by human urine-derived stem cells could prevent kidney complications from type Ⅰ diabetes in rats. Stem Cell Res Ther. 2016; 7(1):24.